Im Zweiten Weltkrieg blieb Jugoslawien zunächst neutral und weigerte sich, dem Dreimächtepakt beizutreten. Das Abkommen wurde erst nach offenen Kriegsdrohungen am 25. März 1941 von der Regierung Cvetković-Maček, und Prinz Paul (Pavle) der ein Vetter von Aleksandar I. Karađorđević war, unterzeichnet. In Folge kam es in Serbien zu großen Demonstrationen, die schließlich am 27. März 1941 in einem pro-britischen Staatsstreich in Belgrad gipfelten, durchgeführt von General Dušan Simović und unterstützt von Petar II. Karađorđević, bei dem die Regierung Paul-Cvetković-Maček gestürzt wurde. Prinz Paul musste nach Griechenland fliehen. Kurz darauf, am 6. April 1941, ließ Hitler Belgrad bombardieren, was innerhalb weniger Tage rund 20.000 zivile Opfer forderte. Die Deutschen führten einen Blitzfeldzug gegen das Land und besetzten es innerhalb weniger Tage, um für das Unternehmen Barbarossa den Rücken frei zu haben. Das Land wurde zerschlagen, dem Unabhängigen Staat Kroatien Syrmien und Bosnien-Herzegowina angegliedert. Montenegro, der Sandschak und der Kosovo wurden von italienischen Truppen Benito Mussolinis besetzt. Die Batschka wurde Ungarn unter Miklós Horthy zugeschlagen, während der Banat und das restliche „Rumpfserbien“ unter deutsche Besatzung fielen. Süd- und Zentralserbien wurden im Laufe des Krieges schließlich zur bulgarischen Okkupationszone, ebenso Mazedonien. Serbien wurde dem „Befehlshaber Serbien“, u. a. Ludwig von Schröder, unterstellt, dessen vorgesetzte Dienststelle der Wehrmachtbefehlshaber Südost in der Person des österreichischen Generals Alexander Löhr war. Schließlich wurde eine Marionettenregierung unter General Milan Nedić eingesetzt, der als zivile Verwaltung nur geringe Kompetenzen eingeräumt wurden. Im Anschluss an die deutsche Besatzung kam es in Serbien Anfang Juli 1941 zu einem Volksaufstand, der sich später auf Montenegro, Bosnien und Kroatien ausweitete.
Der antifaschistische Widerstand in Serbien war zunächst in zwei Lager geteilt: die kommunistische Bewegung unter Josip Broz („Tito“) und die westlich-monarchistischen Tschetniks. Die Jugoslawischen Partisanen warfen den Tschetniks vor, unter Premier Nedić kritiklos den Serbenmord der deutschen und kroatischen Okkupatoren hinzunehmen und sogar offen mit den Besatzern zu kollaborieren. Die Tschetniks, die teilweise von britischen und US-amerikanischen Militärs unterstützt wurden und die den (von Italien geförderten) Ustaschas in Bosnien und Kroatien erfolgreich Widerstand leisteten, warfen den Partisanen im Gegenzug vor, die rücksichtslosen Vergeltungsmaßnahmen der deutschen Besatzer in Serbien zu schüren und einen bolschewistisch-revolutionären Kampf auf Kosten unschuldiger serbischer Zivilisten auszutragen. Es galt die Regel, dass der Tod eines Wehrmacht-Soldaten mit der Erschießung von 100 serbischen Zivilisten vergolten wurde, wobei diese Quote häufig übererfüllt wurde. Einige Tschetnik-Führer, wie Kosta Pećanac und Dimitrije Ljotić, dienten den Besatzern als willige Helfer und beteiligten sich sogar an militärischen Aktionen der Wehrmacht gegen die kommunistischen Partisanen. Dem Zweiten Weltkrieg fielen etwa 1.500.000 Serben zum Opfer, welches ein Viertel der serbischen Bevölkerung im Königreich Jugoslawien ausmachte.