1618 drangen Gesandte der böhmischen Stände (mehrheitlich protestantisch) in die Kanzlei des Hradschin und warfen zwei kaiserliche Statthalter aus dem Fenster (sie wurden dabei nicht getötet). Dieser sogenannte zweite Prager Fenstersturz leitete den Dreißigjährigen Krieg (1618-1648) ein.
1619 starb Matthias. Im August wählten die böhmischen Stände den deutschen Protestanten Friedrich von der Pfalz zum König. Indem er im Herbst in Prag gekrönt wurde und dort seine Residenz aufnahm, wurde der innerhabsburgische Konflikt zu einer Reichsangelegenheit. 1620 kam es zur Schlacht am Weißen Berg.
Friedrich von der Pfalz floh aus dem Land („Winterkönig“, da er nur einen Winter regierte). Es kam zu Hinrichtungen und zum Exil des böhmischen Adels. Die nun beginnende Epoche wird in der tschechischen Geschichte temno, die Zeit der Dunkelheit genannt. Kaiser Ferdinand II. (1619-1637) führte eine Unterdrückungspolitik gegen Nicht-Katholiken.
Protestanten flohen (Comenius) oder wurden hingerichtet. Ein großer Teil des böhmischen Adels floh. In Böhmen wurde Deutsch zur zweiten Amtssprache erhoben und drängte faktisch bald das Tschechische zurück.