Nachdem es kurzzeitig dem neubabylonischen Reich unter Nebukadnezar II. (604 - 562 v. Chr.) angehörte, fiel Damaskus an das achämenidische Perserreich. Strabon (16,2,20) beschreibt es als bedeutendste und glänzendste Stadt des Perserreichs. Parmenion, ein General Alexanders des Großen eroberte Damaskus 332 v. Chr. und erbeutete dabei den Staatsschatz des Dareios. Damaskus wurde dem Alexanderreich eingegliedert und in Folge dessen makedonische Kolonie; im Norden und Osten der aramäischen Stadt entstand eine griechische Siedlung.
Unter der Herrschaft der Seleukiden wird Damaskus ausgebaut und befestigt, 111 v. Chr. von Antiochos IX. zur Hauptstadt von Phönikien und Coelesyrien erhoben. 85 v. Chr. gelang den Nabatäern unter König Aretas III. die Eroberung von Damaskus, wo sie sich bis 66 v. Chr. halten konnte, als ganz Syrien unter Pompeius erobert und dem römischen Reich eingegliedert wurde. Von Marcus Antonius wurde Coelesyrien und damit auch Damaskus 38 v. Chr. (zusammen mit weiteren Reichsteilen) an Kleopatra VII. von Ägypten verschenkt.
Den einst vertriebenen Nabatäern gelang 37 n. Chr. die erneute Eroberung der Stadt. Mit Duldung der Römer konnten sie sich bis 54 halten. Anschließend herrschten wieder die Römer. Die Bedeutung der Stadt stieg im 1. Jahrhundert, weshalb Damaskus kurzzeitig Bischofssitz wurde, den es dann jedoch an Emesa abgeben musste. Kaiser Theodosius I. gründete im 4. Jahrhundert eine Basilika über den vermuteten Reliquien Johannes des Täufers.