Santa Cruz de la Sierra wurde am 26. Februar 1561 von Ñuflo de Chávez in der Nähe der heutigen Ortschaft San José de Chiquitos (ca. 250 km östlich des heutigen Santa Cruz) gegründet; Ñuflo de Chávez benannte die Siedlung nach seinem gleichnamigen Heimatdorf in der spanischen Extremadura, 12 km südlich von Trujillo. Der spanische Ortsname bedeutet Heiliges Kreuz der Berge.
1592 wurde die Stadt an die heutige Stelle verlegt, da sich die ursprüngliche Lage wegen Konflikten mit Ureinwohnern als ungünstig erwiesen hatte. Südlich von San José de Chiquitos (das erst 1750 als Jesuitenmission entstand) können Reste der ersten Siedlung als archäologische Ausgrabungsstätte Santa Cruz la Vieja ("Alt-Santa Cruz") besichtigt werden.
Santa Cruz war lange eine von Landwirtschaft und Viehzucht geprägte Kleinstadt, deren Zweck die Versorgung des Hochlandes mit landwirtschaftlichen Produkten war. Nach der Unabhängigkeit Boliviens wurde Santa Cruz 1826 Hauptstadt des neu geschaffenen gleichnamigen Departamentos, dennoch blieb es eine relativ abgelegene und schwer zu erreichende Kleinstadt.
Anfang des 20. Jahrhunderts verlor Santa Cruz massiv an Bedeutung, da mit der Eröffnung der Eisenbahnlinien vom Hochland an die Pazifikküste der Import landwirtschaftlicher Produkte aus dem Ausland wesentlich billiger wurde als der aufwendige Transport mit Maultieren aus Santa Cruz.
Der wirtschaftliche Aufschwung und das Wachstum von Santa Cruz zur heutigen Bedeutung begannen, nachdem es in den 1950er Jahren durch Hauptstraßen mit dem Rest des Landes verbunden wurde und die umfangreichen Öl- und Gasvorkommen der Region erschlossen wurden.
Aufgrund der inzwischen erreichten Stellung als wirtschaftliches Zentrum Boliviens gibt es politische Strömungen, die eine stärkere Unabhängigkeit von der Zentralregierung in La Paz und regionale Autonomie fordern.