Santo Domingo war seit 1496 von Europäern besiedelt, wurde aber offiziell erst 1498 von Christoph Kolumbus' Bruder Bartolomeo an der Mündung des Flusses Ozama gegründet und ist somit die älteste, von Europäern errichtete Stadt in der Neuen Welt. Sie hieß La Nueva Isabela.
1502 wurde sie wegen eines Hurricans und einer Ameisenplage am Westufer des Flusses Ozama neu gegründet und erhielt den heutigen Namen.
Die Kathedrale Santa Maria de la Encarnación ist die älteste Kathedrale Amerikas (Grundsteinlegung 1521, eingeweiht 1540). 1546 wurde sie von Papst Paul III. zur ersten erzbischöflichen Kathedrale der Neuen Welt erhoben. Sie barg bis 1992 die Gebeine von Kolumbus, die anlässlich der 500-Jahrfeier der Entdeckung Amerikas in den neuen Faro de Colón überführt wurden.
1538 wurde hier die älteste Universität Amerikas eröffnet. Während der Trujillo-Diktatur hieß Santo Domingo von 1936 bis 1961 Ciudad Trujillo.