Die Stadt ist auch ein wichtiger Eisenbahnknoten. Vom Stuttgarter Hauptbahnhof führen Strecken nach Karlsruhe–Straßburg–Paris (ab Sommer 2007 mit TGV-Verbindungen, siehe LGV Est européenne), nach Mannheim–Frankfurt am Main–Köln/Hamburg/Berlin, nach Ulm–München–Wien, nach Rottweil/Freudenstadt–Singen am Hohentwiel–Zürich, nach Nürnberg, nach Tübingen und nach Heilbronn–Würzburg/Mosbach. Zum Eisenbahnknoten Stuttgart gehören auch das Containerterminal in Stuttgart-Obertürkheim und der Rangierbahnhof im benachbarten Kornwestheim, der über eines der modernsten Container-Terminals im Bereich der DB verfügt. Beide Terminals sind der DUSS (Deutsche Umschlaggesellschaft Schiene-Straße) zugehörig. Im Jahr 1991 begann der ICE-Schnellverkehr auf der Linie Hamburg–Frankfurt–Stuttgart–München. Im Zuge dessen wurde die neue Schnellfahrstrecke von Stuttgart nach Mannheim eingeweiht, auf der planmäßig mit 250 km/h gefahren wird. 1997 hat der Stuttgarter Gemeinderat den Rahmenplan für das Projekt Stuttgart 21 verabschiedet. Der Bebauungsplan wurde im Oktober 2003 veröffentlicht. Das Kernstück des Projekts ist der Bahnhof 21, welcher komplett unterirdisch gebaut werden soll. Zum Projekt gehören zudem eine Anbindung an den Stuttgarter Flughafen und an die Neubaustrecke Wendlingen–Ulm (eine Hochgeschwindigkeitsstrecke als Teil der Magistrale für Europa).