Das alte Mesopotamien fällt 539 v. Chr. bei der Unterwerfung Babyloniens an das aufstrebende Perserreich unter Kyros. Unter den Achämeniden wird Mesopotamien zeitweilig in die zwei Satrapien Syria und Assyria aufgeteilt, nach der Eroberung durch Alexander den Großen nach der Schlacht bei Gaugamela 331 v. Chr. werden beide Satrapien jedoch zu einer neuen Satrapie Mesopotamien zusammengeführt. Nach der Schlacht von Gaza 312 v. Chr. gerät Mesopotamien unter die Kontrolle des Seleukidenreichs und bleibt fortan für fast zwei Jahrhunderte von weiterem Kriegsgeschehen verschont. In dieser Zeit blühen nicht zuletzt die hellenistischen Stadtgründungen auf (etwa Apameia, Dura Europos, Edessa, Seleukia etc.).
Nach dem Tod des Seleukidenkönigs Antiochos Sidetes 129 v. Chr. fällt Mesopotamien endgültig an die Parther, die zuvor schon den Iran erobert haben. Ktesiphon wird zur parthischen Hauptstadt, daneben gelangt auch Hatra zu besonderer Bedeutung. Teile Mesopotamiens gelangen zwischen 83 und 69 v. Chr. an Armenien, werden allerdings im Zuge der römisch-parthischen Einigung nach der Schlacht bei Carrhae den Parthern zurückgegeben. In der Folgezeit stabilisiert sich der Euphrat als Grenze zwischen römischer und parthischer Einflusssphäre. Versuche des römischen Kaiser Trajans, Mesopotamien zwischen 114 und 117 zu annektieren, scheitern zunächst, doch nach dem Partherkrieg des Lucius Verus von 162 bis 165 bleiben größere Teile Mesopotamiens im römischen Einflussbereich. 195 fällt Mesopotamien bis auf die strategisch wichtige Stadt Nisibis wieder an die Parther, wird von Kaiser Septimius Severus 197 aber wieder zurückerobert und befestigt.
Auch der Wechsel von der dezentral-feudalen Partherherrschaft zum stärker zentralisierten Sassanidenreich bringt zunächst keine grundlegenden Veränderungen mit sich. Erst in der zweiten Hälfte des 3. Jahrhunderts gerät Mesopotamien in den Strudel der Reichskrise des 3. Jahrhunderts und wechselweise unter römische und sassanidische Kontrolle. Während der gesamten Spätantike ist Mesopotamien Aufmarsch- und Kampfgebiet dieser beiden antiken Großmächte, wobei der arabische Stamm der Lachmiden einen wichtigen Teil der Grenzsicherung für Persien übernimmt. Dem römischen Kaiser Diokletian gelingt es 297/298 die alten Besitzverhältnisse wiederherzustellen. Erst ab 337 beginnt der bedeutende Sassanidenkönig Schapur II. große Teile Mesopotamiens zurückzuerobern. Der gescheiterte Perserfeldzug von Kaiser Julian führt 363 schließlich zum Verlust fast ganz Mesopotamiens und insbesondere von Nisibis an Persien. Trotz verschiedener Versuche von beiden Seiten, den Grenzverlauf zu verschieben, bleibt dieser im Wesentlichen unverändert, bis schließlich Mesopotamien und Syrien im Zuge der Islamischen Expansion zwischen 633 und 640 von den Arabern erobert werden.