Die Gründungsgeschichte Guayaquils ist ebenso wie die Herkunft des Namens unsicher. Eine Stadt namens Santiago (de Quito) wurde erstmals als Ausgangspunkt für Vorstöße zur Pazifikküste bereits 1534 von Diego de Almagro und Sebastián de Benalcázar gegründet, allerdings am Colta-See in der Nähe des heutigen Riobamba. Da ihre Lage den Ansprüchen der Conquista nicht genügte, wurde sie schrittweise an die Küste verlegt. Dabei wurde sie mehrfach von einheimischen Kämpfern der Chola-, Chone-, Puna- und Huancavilca-Indianer zerstört.
Bis 1542 erscheint der Posten in Urkunden als Santiago de la Culata, da die Siedlungsgebiete der Huancavilca von der Verwaltung in Quito (seit 1539/40) als Provincia de la Culata bezeichnet wurden. Seit Dezember 1542 taucht der Name Guayaquil auch als Gebietsbezeichnung wiederholt auf und scheint sich mit der zunehmenden "Familiarisierung" der Spanier mit den Einwohnern der Region langsam durchzusetzen.
Der Legende nach verweist der Name Guayaquil auf einen legendären Häuptling der Puruhá-Indianer namens Guayas und seine aus dem Hochland stammende Frau Quill, die dieser der Legende nach getötet haben soll, bevor er sich ertränkte, um nicht den Spaniern in die Hände zu fallen. Vermutlich war Guayaquil jedoch die Bezeichnung für einen Ort und seinen Häuptling und Quill/Kil eine Quellgöttin bzw. die Bezeichnung wasserreicher Gebiete. Die Legende um Guayas und Quill kann so als eine Allegorie auf den Untergang der Huancavilca-Indianer interpretiert werden. Es existieren aber weitere linguistische Erklärungsansätze, nach denen Guayaquil etwa im Tsafiki, der präinkaischen Sprache der heutigen Colorado-Indianer "Unser großes Haus" bedeutet. [1], [2]
Das um 1542/3 gegründete erste Santiago de Guayaquil wurde nach der Erhebung des Gonzalo Pizarro gegen Vizekönig Blasco Núñez Vela (seit 1544) von königstreuen Truppen nochmals verlegt. Am 25. Juli 1547 soll die Stadt von den Kapitänen Francisco de Olmos, Rodrigo Vargas de Guzmán und Toribio de Castro ein letztes Mal an ihrem heutigen Standort gegründet worden sein. Der 25. Juli ist in der katholischen Kirche der Gedenktag des Apostels Jakobus (span. Santiago).
Nach anderen, nicht zwingend widersprüchlichen Angaben gilt Francisco de Orellana als Gründer Guayaquils. Diese Angabe bezieht sich wahrscheinlich auf eine für 1537 oder 1538 angegebene Gründung einer der Vorgängerinnen des heutigen Guayaquil.