In der Kolonialzeit wurde Guayaquil bald zu einer bedeutenden Hafenstadt des Vizekönigreichs Peru und später Neugranadas, über die einerseits die Produkte der Küstenregion (Holz, später auch Kakao und Erdnüsse) abtransportiert wurden und andererseits Produkte aus anderen Kolonien und aus Spanien anlandeten. Ihre geografische Lage auf halber Strecke zwischen Lima und Mittelamerika verstärkten seine Bedeutung ebenso wie das weit ins Inland reichende Flusssytem. Guayaquil entwickelte sich zu einem der bedeutendsten Werft-Standorte in Südamerika.
Durch seine exponierte Lage wurde Guayaquil im 17. und 18. Jahrhundert mehrfach von Piraten und Freibeutern angegriffen und geplündert. Die Encyclopædia Britannica (1911) notiert folgende Angriffe: 1624 durch Jacob Clark, 1686 durch französische Piraten, 1687 durch englische und französische Freibeuter unter Edward Davis, George Hout und Pierre Le Picard, 1707 durch William Dampier und 1709 durch Woodes Rogers und Etienne Courtney. Der letztgenannte Angriff endete mit der Flucht der Piraten vor einer Gelbfieberepidemie. Die Angriffe des späten 17. Jahrhunderts führten zur Verlegung des Stadtzentrums Richtung Süden. Ferner wurden 1730 und 1763 die Befestigungs- und Verteidigungsanlagen verstärkt.
Auch durch Feuer wurde Guayaquil mehrfach heimgesucht, darunter 1707, 1784, 1865, 1896 und 1899.