Die siegreichen Spanier zerstörten systematisch jede sichtbare Erinnerung an die alte Kultur und erbauten dort, wo die großen Tempel standen, ihre Kirchen. Auf den Fundamenten des Herrscherpalastes wurde ein Palast für Cortés errichtet, zum Neubau wurden die Steine der Aztekenstadt verwendet. Als die Stadt weiter angewachsen war, legten sie den größten Teil des Lago de Texcoco trocken. Von dort unternahmen die Spanier Expeditionen und unterwarfen die amerikanischen Ureinwohner bis weit in den Norden in die heutigen USA und in den Süden bis nach Mittelamerika.
Mexiko-Stadt wurde 1535 die Hauptstadt des Vizekönigreichs Neuspanien, das alle spanischen Provinzen in Amerika nördlich von Costa Rica, die karibischen Inseln und auch die Philippinen umfasste. Die spanische Kolonialherrschaft währte rund drei Jahrhunderte. 1551 eröffnete in der Hauptstadt die erste Universität des Landes (UNAM).
1692 kam es in Mexiko-Stadt zu einem Aufstand der Indios, bei denen viele Gebäude zerstört oder beschädigt wurden, darunter auch der 1523 auf dem Palast der Azteken errichtete Amtssitz der spanischen Vizekönige. Auslöser der Unruhen waren Versorgungsengpässe bei Nahrungsmitteln, die auf schlechte Ernten infolge von langanhaltenden Niederschlägen und Überschwemmungen in der Region zurückzuführen waren.
1737 wurde die „Jungfrau von Guadalupe“ von der Katholischen Kirche zur Schutzpatronin von Mexiko-Stadt erklärt. Im 18. Jahrhundert baute man zahlreiche Kirchen und Gebäude im Stil des Barock, woraus sich später der mexikanische Churriguera-Stil entwickelte.
1810 kam es unter der Führung von Miguel Hidalgo und José María Morelos zum Unabhängigkeitskrieg, der 1821 mit der Einnahme der Stadt durch Rebellen unter der Führung von Agustín de Iturbide siegreich beendet wurde. Am 21. Juli 1822 erfolgte seine Ernennung zum Kaiser. Am 14. September 1847 wurde Mexiko-Stadt im Mexikanisch-Amerikanischen Krieg von den US-Streitkräften unter General Winfield Scott eingenommen und fünf Monate lang besetzt.
Von 1863 bis 1867 wurde die Stadt von Kaiser Maximilian und der französischen Armee regiert. Erobert wurde sie nach harten, tagelangen Kämpfen unter der Führung des Schweizer Hpt. Stöckli, der in der Fremdenlegion diente. Der 1858 zum Präsidenten gewählte Benito Juárez vertrieb 1866 die Franzosen aus Mexiko-Stadt und dem ganzen Land. Nach dem Sieg über die Franzosen überwachte er 1867 persönlich die standrechtliche Exekution von Kaiser Maximilian I. in Querétaro, den Napoléon III. als Statthalter 1864 eingesetzt hatte und übernahm die Regierungsgeschäfte in Mexiko-Stadt.
Um 1875 umfasste die Stadt kaum mehr als das Gelände um den Zócalo, welcher der zentrale Platz vor der Kathedrale ist, und die Alameda. Das Schloss Chapultepec, Coyoacán, San Ángel und die Basílica de Guadelupe - inzwischen weit im Inneren der Stadt gelegen - waren damals von Feldern und den letzten noch verbliebenen Seen umgeben. Doch die Stadt zeigte schon die ersten Züge ihrer heutigen Form: der Paseo de las Reformas verband bereits Chapultepec mit der Innenstadt, und die zunehmende Einwohnerschaft quoll über den kolonialen Stadtkern hinaus. Von Ende 1870 bis 1911 ließ sich der Diktator Porfirio Díaz mittels eines zuvor nie da gewesenen Bauprogrammes selbst ein Denkmal setzen. Straßenbahnlinien wurden errichtet sowie die letzten Reste des Lago de Texcoco am Stadtrand trockengelegt. Diese Maßnahmen brachten ein weiteres Anwachsen der Bevölkerung mit sich und bei Ausbruch der Revolution im Jahre 1910 hatte La Ciudad de México mehr als 700.000 Einwohner.