Nach der Annexion 1801 wurde Georgien Teil des Russischen Reiches und Tiflis Hauptstadt des gleichnamigen Gouvernements (russisch: Tiflisskaja Gubernija). Russland verwaltete von dort aus den Kaukasus. In der georgisch-orthodoxen Sioni-Kathedrale zwang der russische General Knorring am 12. April 1802 die georgische Aristokratie und Geistlichkeit mit Waffengewalt zum Eid auf die russische Zarenkrone.
Russland förderte andererseits den Handelsplatz, befreite einen Großteil der in Tiflis verkauften Waren sowie Transitgüter von Steuern. Die Stadt erblühte und die Bevölkerung wuchs von 8.500 im Jahr 1811 auf 20.000 im Jahr 1825.
Das heutige Stadtbild prägte sich in der Mitte des 19. Jahrhunderts aus. Auf Initiative des russischen Vizekönigs Fürst Michail Woronzow wurde die Stadt nach 1845 modernisiert und erweitert. Er berief den Italiener Giovanni Scudieri als Chefarchitekten, gründete das erste Theater und die erste öffentliche Bibliothek in Transkaukasien. Die alten Stadtmauern wurden abgerissen und Tiflis dehnte sich nach Norden und Westen aus.
Im heutige Stadtzentrum, an der Allee Rustawelis Gamsiri, wurden elegante Paläste, Hotels, Wohnhäuser und Museen im Stil des Klassizismus, des Barock und später des Jugendstils gebaut. Der deutsche Landschaftsarchitekt Heinrich Scharrer legte den Alexanderpark im Stadtzentrum an. Um den Handel zu stärken, wurde die Tiflisstraße gebaut, Tiflis 1872 per Eisenbahn mit Poti und 1883 mit Batumi sowie Baku verbunden.
Die Zahl der Industrieunternehmen wuchs von 138 im Jahr 1864 auf 228 im Jahr 1883. 1886 hatte Tiflis 104.024 Einwohner. Es handelte sich hauptsächlich um Georgier, Armenier und Russen, aber auch um Deutsche, Tataren, Perser und Polen. 1897 lebten in der Stadt bereits rund 169.000 Menschen. 1883 fuhr in Tiflis die erste Pferdestraßenbahn. Ab 1904 wurden elektrische Straßenbahnen eingerichtet.